ARTIGO CIENTÍFICO

Prospecção fitoquímica e avaliação antimicrobiana de Sida planicaulis Cav. (Malvaceae) sobre leveduras potencialmente patogênicas

Phytochemical prospecting and antimicrobial evaluation of Sida planicaulis Cav. (Malvaceae) on pathogenic yeast

Ana Laura de Cabral Sobreira¹, Nayana da Rocha Oliveira², Danielly Albuquerque da Costa³, Egberto Santos Carmo^4*

¹Pós-Graduanda em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos; Universidade Federal da Paraíba; João Pessoa; 83996667565, lauracabralas@gmail.com; ²Farmacêutica, Universidade Federal de Campina Grande, nayrochy@hotmail.com; ³Professora Doutora lotada no Departamento de Fisiologia e Patologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, ac_danielly@hotmail.com; ⁴Professor Doutor do Bacharelado em Farmácia, da Unidade Acadêmica de Saúde, do Centro de Educação e Saúde, Universidade Federal de Campina Grande, campus Cuité/PB, egbertosantos@ufcg.edu.br

Recebido para publicação em 10/02/2018; aprovado em 12/06/2018

Resumo: As espécie vegetais são utilizadas cada vez mais como fontes medicinais para a descoberta de moléculas biologicamente ativas. A espécie Sida planicaulis Cav. apresenta uma distribuição por todo o território brasileiro, é conhecida popularmente como vassoura e utilizada na medicina popular para tratar dor no corpo. Embora haja seu uso pela comunidade, esta espécie não possui estudos químicos ou farmacológicos comprovados cientificamente. Portanto, este trabalho objetivou determinar a composição química do extrato etanólico bruto (EEB) e das fases hexânica, clorofórmica, acetato de etila e hidroalcoolica de Sida planicaulis Cav. avaliando o potencial fúngico frente leveduras potencialmente patogênicas, utlizando os valores dos halos de inibição para determinar a atividade antifúngica. Observou-se na prospecção fitoquímica a presença de alcalóides, flavonóides, esteróides, triterpenos, saponinas e taninos. As leveduras Candida tropicalis, Geotrichum 57839, Rhodotorula spp e Trichosporon inkin LM- 67 apresentaram resistência frente ao EEB e às respectivas fases de Sida planicaulis Cav., não sendo observado halo de inibição. O estudo contribui para extração, purificação e isolamento de futuros metabólitos secundários. Sugere então que EEB e as fases de Sida planicaulis Cav. não sejam utilizados para tratar infecções causadas por estes fungos.

Palavras-chave: Produto Natural; Metabólito secundário; Antifúngico.

Abstract: Plant species are increasingly used as medicinal sources for the discovery of biologically active molecules. The species Sida planicaulis Cav. presents a distribution throughout the Brazilian territory, it is popularly known as “vassoura” and it is used in folk medicine to treat pain in the body. Although it is used by the community, this species does not have scientifically proven chemical or pharmacological studies. In this way, this work aimed to determine the chemical composition of BSE and the hexane, chloroform, ethyl acetate and hydroalcoholic phases of Sida planicaulis Cav. and evaluate the fungal potential against potentially pathogenic yeasts, using the values of inhibition halos to determine antifungal activity. The presence of alkaloids, flavonoids, steroids, triterpenes, saponins and tannins was observed in phytochemical prospecting. Yeast Candida tropicalis, Geotrichum 57839, Rhodotorula spp and Trichosporon inkin LM-67 presented resistance against BSE and the respective phases of Sida planicaulis Cav., with no halo of inhibition being observed. The study contributes to the extraction, purification and isolation of future secondary metabolites and suggests that BSE and the stages of Sida planicaulis Cav. are not used to treat infections caused by these fungi.

Key words: Natural product; Secondary metabolite; Antifungal.

INTRODUÇÃO

As plantas medicinais têm sido uma rica fonte de moléculas ativas com potencial terapêutico utilizadas para o tratamento de diferentes enfermidades. No entanto, é preocupante a forma como estão sendo usadas indiscriminadamente. Devido a isto, se tornaram alvo de inúmeras pesquisas científicas, as quais procuram avaliar sua composiçao tóxica, química e farmacológica (GRÜNER et al, 2012).

O conhecimento científico de compostos bioativos oriundos de espécies vegetais apresenta um crescimento lento, apenas 8% anualmente. Embora o Brasil seja responsável por possuir a maior diversidade vegetal do planeta e tenha conhecimento de que muitas planas medicinais fazem parte do uso popular, o número de informações ainda é insuficiente (SILVA et al., 2010; CORRÊA; SALGADO, 2011).

Os estudos realizados com plantas a partir de um conhecimento popular se torna mais efetivo do que escolher ao acaso. Há então uma associação e compartilhamento de conhecimentos entre a etnobotânica, a fitoquímica e a farmacologia. Este enfoque interdisciplinar é de importante relevância para ampliar as buscas das espécies vegetais que apresentem caratér biologicamente ativo.

O Brasil é um país de caráter tropical e suas espécies vegetais produzem de três a quatro vezes mais metabólitos ativos que as plantas de regiões onde o clima predominante é o temperado. Sendo assim, as espécies vegetais brasileiras assumem grande significância na obtenção de fontes naturais de princípios ativos com potencial atividade biológica, possibilitando sua utilização no tratamento de enfermidades (CAVALCANTI et al., 2012).

O gênero Sida apresenta ampla distribuição neotropical com espécies representadas nas Américas. No Brasil, estima-se a ocorrência de cerca de 95 espécies do gênero, das quais 57 são endêmicas, distribuídas de norte a sul do país, representadas principalmente nas regiões Nordeste e Sul. Espécies do gênero são utilizadas na medicina popular para tratar problemas de estômago, tosse, coqueluche, febre, dor articular, enxaqueca, também como estimulante sexual, entre outras atividades (AKILANDESWARI et al., 2010; CASTRO; CAVALCANTE, 2010).

Estudos químicos com espécies de Sida identificaram a presença de uma variedade de metabólitos secundários, tais como: ácidos graxos (SILVA et al, 2010), diterpenos (BHATT et al, 1983), esteróides, flavonóides (SILVA et al., 2006), compostos nitrogenados (alcalóides) (PYREK; CHARI, 1983; WOLDEYES et al., 2012; CHAVES et al., 2013) e ecdiesteróides (LEAL, 2008), demonstrando desta forma ser um gênero rico em metabólitos secundários.

A espécie Sida planicaulis Cav. pertence à família Malvaceae, é uma planta nativa, não endêmica do Brasil, conhecida popularmente como vassoura ou guanchuma. Está distribuída por todo o território brasileiro, principalmente na região nordeste. Apesar de esta ser utilizada tradicionalmente para tratar dor no corpo, é pouco estudada, particularmente no que concerne aos constituintes químicos e atividade biológica (COSTA, 2002; BRITO; SENNA-VALLE, 2012).

Nos últimos anos, a incidência de micoses tem aumentado drasticamente e se tornado um sério problema de saúde pública, o que se deve ao crescente número de pacientes com imunodeficiências inatas ou adquiridas (REX et al., 1997; MENCACCI et al., 2000). Outro fator que contribui é o uso crescente de terapia com antibióticos de largo espectro (KATZUNG et al., 2014), apresentando um grande desafio para os profissionais da saúde.

Segundo Fenner et al. (2006), Epidermophyton, Microsporum, Trichophyton, Paracoccidioides, Histoplasma ou os fungos patógenos oportunistas Candida albicans, C. krusei, Cryptococcus neoformans são os principais fungos responsáveis pelo estabelecimento de uma infecção fúngica.

Em um estudo multicêntrico recente, realizado com quatorze países na Europa para verificar a prevalência de candidose invasiva em pacientes admitidos em unidade de terapia intensiva, observou-se que para cada mil admissões nove exibiam essa micose. Quando se tratava de pacientes que haviam sido submetidos à cirurgia, a taxa de mortalidade era de 38,8% (KLINGSPOR et al., 2015).

Em detrimento da resistência desenvolvida pelos fungos aos antifúngicos comercializados, o tratamento das micoses não é sempre efetivo, e esse problema é exacerbado pelas incontáveis reações adversas que estes fármacos podem apresentar. Em vista disso, há uma busca constante por novas substâncias que apresentem ação antifúngica mais potente e segura (ZACCHINO, 2001).

Este estudo teve como objetivo a caracterização de alguns grupos de metabólitos secundários presentes e a avaliação antifúngica do Extrato etanólico bruto e das fases hexânica, clorofórmica, acetato de etila e hidroalcoólica das partes aéreas de Sida planicaulis Cav., como uma forma de contribuir na prospecção de possíveis compostos ativos desta espécie medicinal e determinar futuros estudos farmacológicos.

MATERIAL E MÉTODOS

Local de Trabalho

O trabalho foi realizado nos Laboratórios de Fitoquímica e Microbiologia da Unidade Acadêmica de Saúde (UAS), do Centro de Educação e Saúde (CES), da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), Campus Cuité-PB.

Material Vegetal

As partes aéreas de Sida planicaulis Cav. foram coletadas no bairro Eucalipto (Cuité-PB) em abril de 2014. A identificação botânica foi realizada pelo botânico Prof. Dr. Carlos Alberto Garcia Santos, havendo uma exsicata da espécie depositada no Herbário do Centro de Educação e Saúde sob o código 201, na Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), Campus Cuité-PB.

Preparo do material vegetal e obtenção do extrato etanólico bruto (EEB)

As partes áreas coletadas foram submetidas à secagem em temperatura ambiente e posteriormente trituradas em moinho mecânico, fornecendo assim 1.800g de pó. Este pó foi submetido ao processo de maceração em etanol 96% durante 48h, com seis repetições. Em seguida, a solução extrativa resultante foi concentrada em evaporador rotativo, proporcionando 162,28g do extrato etanólico bruto (EEB).

Particionamento do extrato etanólico bruto

O extrato etanólico bruto foi diluído em MeOH:H₂O 7:3 e em seguida submetido a uma cromatografia líquido-líquido, utilizando solvente com gradiente crescente de polaridade, sendo eles: hexano, clorofórmio e acetato de etila. Desta forma, as respectivas soluções obtidas após o particionamento foram novamente concentradas em evaporador rotativo, resultando em: 39,10g da fase hexânica, 21,68g da fase clorofórmica, 2,41g da fase acetato de etila e 67,96g da fase hidroalcoólica.

Prospecção fitoquímica

O EEB das partes aéreas de Sida planicaulis Cav. e as respectivas fases obtidas após o particionamento (hexânica, clorofórmica, acetatoetílica e hidroalcoólica) foram submetidos à triagem fitoquímica, com o objetivo de identificar a presença dos metabolitos secundários, empregando-se testes qualitativos com reagentes específicos para cada classe, sendo eles: esteroides e triterpenos (Lieberman-Burchard), flavonoides (Shinoda), taninos (Gelatina e FeCl3), alcaloides (Dragendorff) e saponinas (Índice de espuma), seguindo a metodologia descrita por Matos (2009) ou Biavati et al. (2007).

Armazenamento

Os produtos permaneceram armazenados em um frasco âmbar e mantidos sob refrigeração a uma temperatura inferior a 4°C, no Laboratório de Microbiologia. As diferentes soluções foram preparadas no momento das execuções dos ensaios, dissolvidas, quando necessário, em DMSO (dimetilsulfóxido) e/ou Tween 80®.

Preparação das amostras de Sida planicaulis Cav. para testes antifúngicos

As amostras correspondentes a 0,01g de EEB e das respectivas fases após o particionamento foram devidamente pesadas em balança analítica e, posteriormente, diluídas em 1 mL de água destilada estéril, obtendo, assim, uma concentração inicial de 10.000μg/mL. Em seguida foi adicionado Tween 80 e DMSO para a homogeneização das fases.

Produtos controle

Utilizou-se ASD com o microrganismo como controle positivo para as leveduras.

Fungos

As leveduras utilizadas nos ensaios de atividade biológica do EEB e das fases de Sida planicaulis Cav. foram cedidas pelo laboratório de Microbiologia do Centro de Educação e Saúde (CES) da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG) e consistiram nas seguintes espécies: Candida tropicalis, Trichosporon inkin LM-67, Geotrichum 57839, Rhodotorula spp.

Meio de cultura

Ágar Sabouraud Dextrose (ASD), adquirido da Sigma®, foi o único meio de cultura utilizado nos ensaios microbiológicos, preparado de acordo com as instruções do fabricante. Foi solubilizado com água destilada e esterilizado em autoclave, a 121°C, por 15 minutos.

Inóculo

Na preparação do inóculo dos fungos leveduriformes, os isolados foram cultivados em meio ASD inclinado a 35°C por 24 horas (overnight). Inicialmente foram preparadas suspensões dos microrganismos em tubos contendo salina estéril (NaCl a 0,85% p/v). Todas as suspensões foram agitadas por 2 minutos com auxílio do Vortex. Após agitação, cada suspensão teve sua turbidez comparada e ajustada àquela apresentada pela suspensão de sulfato de bário do tubo 0,5 da escala McFarland, a qual corresponde a um inóculo de aproximadamente 10⁶ unidades formadoras de colônias/mL (UFC/mL) (HADACEK; GREGER, 2000; BARROS et al., 2006).

Triagem microbiológica

A técnica utilizada para avaliar o potencial antifúngico foi difusão em meio sólido com discos de papel de filtro (HADACEK; GREGER, 2000). As placas de Petri estéris foram preenchidas com 20 ml do meio ASD fundido a 50ºC. Após solidificação dos meios, com o auxilio de um swab estéril as placas foram semeadas com a suspensão recém preparada dos microrganismos (10⁶ UFC/mL). Em seguida, discos de papel de filtro embebidos com 20 μL do produto teste foram depositados na superfície do meio de cultura ao centro da placa. Para as leveduras o sistema ficou incubado a 36ºC por 24/48 horas, e para os fungos filamentosos o sistema ficou incubado a 28ºC por 7-15 dias. Os ensaios foram realizados em triplicata e o resultado expresso pela média aritmética dos halos de inibição obtidos. A atividade antifúngica foi considerada positiva quando a média dos halos de inibição foi superior ou igual a 10 mm de diâmetro.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O EEB e as fases obtidas das partes aéreas de Sida planicaulis Cav. indicaram a presença de diferentes grupos de metabólitos secundários, sugerindo a biodisponibilidade de alcaloides, flavonoides, esteroides, triterpenos, saponinas e taninos, sendo os taninos, flavonoides e alcaloides os compostos que prevaleceram na espécie (Tabela 1).